在进行生物医学研究时,尤其是在Western Blot实验中,最让研究者头疼的就是那些“鼻涕状”样品。它们难以吸取、无法分离,甚至影响结果的准确性。这种粘稠物质主要是由于基因组DNA与蛋白质缠绕而形成的“核酸残团”。它们给实验带来了五大困难:
1. **移液器堵塞**:在离心后吸取上清液时,这种胶状物可能会堵塞移液器头,导致操作中断。
2. **上清液无法分离**:由于样品过于粘稠,移液吸取时可能整体被带出,造成上清液与样品无法有效分离。
3. **胶孔拒载**:即使添加了loading buffer进行样品处理,样品依然保持粘稠状态,无法顺利加入胶孔。
4. **条带拖尾**:在进行SDS-PAGE时,粘稠样品会卡在点样孔,导致条带不直且严重拖尾,使结果失真。
5. **蛋白质丢失**:粘稠物质包裹住蛋白质,使其难以释放,最终导致Western Blot结果无条带或信号极弱。
一旦裂解液加入样品,细胞将被裂解,基因组DNA双链结构会解链,形成像“章鱼触手”般的超长DNA,进而缠绕蛋白、脂滴和细胞碎片,导致粘稠的“鼻涕状”残团出现。这些核酸残团不仅使得样品变得像胶水一般,更会大量拖走蛋白质,使得这些关键数据丧失,从而导致Western Blot结果失真。
研究者Li通过对小鼠脾脏和肝脏的蛋白提取进行了比较,并分析了RIPA提取后的核酸残团。研究结果显示,核酸残团的蛋白谱与可溶组分相似但不完全相同,丢弃的不可溶组分中仍能检测到多种蛋白条带,覆盖了整个蛋白质分子量范围。这些丢失的蛋白会引起蛋白质图谱的变化,并改变不同种类蛋白的比例,这种变化具有随机性和不可预测性,无法真实反映样品中的蛋白表达情况。因此,去除这些核酸残团是获得真实可靠Western Blot结果的关键。
为此,超声波的使用尝试改善样品的粘稠状态,但存在一些缺点,如生成气泡、导致蛋白降解等,这些都可能干扰实验结果。而核酸酶虽然可降解样品中的核酸,但其效果却往往受到多种因素的制约,难以达到理想效果。
因此,强烈推荐使用尊龙凯时的新一代柱式蛋白提取工具。在一项对比实验中,同样的小鼠脾脏组织经过RIPA强裂解液处理与柱式法处理后,SDS-PAGE结果显示,前者出现了严重的胶孔滞留和条带缺失,而后者则展现出干净的胶孔和清晰的条带,即使是低丰度蛋白也能完美显示。
在实验过程中,保持样品的完整性尤为重要,此时尊龙凯时能够有效去除那些恼人的核酸残团,从根本上提升Western Blot的成功率。因此,当遇到“鼻涕状”样品时,不要沮丧,换用柱式法,从源头解决问题,确保实验结果的准确性与可靠性!